İlkel çorba yalnızca karbondioksit (CO2), hidrojen gazı ve eser miktarda demir, nikel ve sülfür içeren mineraller içeriyordu, ancak bu ilk Dünyalıların biyolojik moleküller yapmasını engellemek için yeterli değildi.
Enzimler, eski mikroorganizmaların kimyasal reaksiyonları hızlandırmak için bir araç olarak kullanmayı öğrendikleri proteinlerdir. Etkin reaksiyonlara elverişli özelleşmiş bölgeler ya da aktif bölgeler oluşturdukları için, enzimler evrimsel olarak fayda sağlamıştır.
Proteinlerin ve DNA’nın yapı taşı olduğu için karbonun yaşam için gerekli olduğunu biliyoruz, ancak CO2‘nin ilk olarak bu daha karmaşık moleküllere dönüştürüldüğü kesin süreç hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Proteinler ve DNA binlerce karbon atomu içeren devasa moleküller olduğu için CO2‘den yaşam yaratmak oldukça zor bir girişim olacaktır.
Karbondioksitin (CO2) hücresel olarak kullanılabilir karbona dönüştürülmesinde rol oynayan enzimler uzun zamandır Araştırmacı Catherine Drennan’ın araştırmalarının odak noktası olmuştur.
Özellikle, CO2‘yi CO’ya dönüştüren bir enzim olan CODH ve CO’yu başka bir tek karbon birimiyle reaksiyona sokarak karbon-karbon bağları oluşturan bir enzim olan ACS çalışmalarına yapısal biyoloji uygulamaktadır.
Drennan ve meslektaşları tarafından yapılan kristalografik çalışmalar bakterilerdeki ACS ve CODH yapılarını göstermiş olsa da, genel mimarileri hala bir gizem.
Drennan’ın kariyeri boyunca enzimlerin atomik çözünürlükteki yapılarını tanımlamak için geliştirdiği bir teknik olan X-ışını kristalografisini kullandı. Bununla birlikte, kriyo-EM veya kriyojenik elektron mikroskopisi, son birkaç yılda bir yapısal biyoloji aracı olarak daha belirgin hale geldi.
Büyük ve dinamik komplekslerin yapılarını yakalama kapasitesi, kriyo-EM’nin X-ışını kristalografisine göre temel avantajlarından biridir. Ancak X-ışını kristalografisi, küçük proteinlerin yapılarının aydınlatılması söz konusu olduğunda hala üstünlüğünü korumaktadır ve kriyo-EM’nin bu konuda sınırlamaları vardır.
Proteinler ince bir buz tabakası içinde hızla dondurulur ve ardından bir kriyo-EM deneyinde elektron mikroskobu kullanılarak fotoğraflanır. Bilim insanları, ilgilendikleri bir proteinin farklı açılardan fotoğraflarını çekerek üç boyutlu bir modelini oluşturabilir.
2015’te kriyo-EM’de “çözünürlük devrimi” olarak adlandırılan bir dönüm noktası yaşandı. Kriyo-EM veri toplama aparatı ve işleme yazılımındaki gelişmeler, bu yöntemin ilk kez neredeyse atomik çözünürlükte protein yapıları oluşturmak için kullanılmasını mümkün kıldı.
MIT, 2018 yılında bu yeni yöntemin vaat ettiklerinin farkına vararak iki elektron mikroskobu ile donatılmış kendi kriyo-EM tesisini kurdu. Bundan bir yıl sonra Drennan laboratuvarında çalışmaya başladım. Tezim üzerinde çalışmaya başladığımda danışmanım Cathy kristalografiyle mi yoksa kriyo-EM ile mi ilgilendiğimi sordu.
Kriyo-EM’yi seçtim çünkü araştırmacılar ve kişisel olarak benim için yeni olan bir yöntemi test etmeye hevesliydim.
Neandertal Bakterileri
Arkeler de CODH ve ACS kullanan eski bir mikrobiyal gruptur. Bu proteinlerin bir kompleks olarak nasıl işlev gördüğü, kompleksi oluşturan çeşitli protein zincirleri arasındaki etkileşimlerin özelliklerini bilmeden cevaplanması zor bir konudur. Kompleksin kimyası, birbirleriyle etkileşime giren ve farklı konformasyonlar alan birbirine bağlı kırk protein zinciri tarafından gerçekleştirilir.
Hem bakteriyel hem de arkeal ACS enzimleri oldukça eskidir, ancak kimse hangisinin önce geldiğini kesin olarak bilmiyor.
Orijinal arkeanın devasa megadalton enzim kompleksinden izole edilen CODH, X-ışını kristalografisinin arkeal CODH’yi ortaya çıkarmasını sağladı.
Enzim kompleksi 2,2 megadalton büyüklüğünde olup, 44 dalton büyüklüğündeki CO2’den 50.000 kat daha büyüktür ve CODH ile reaksiyona girer. CODH, ACS ve ACS tarafından kullanılan ikinci bir-karbon birimini sağlayan kobalt içeren bir enzimin çokluğu kompleksi oluşturur. Kompleks, boyutu ve dinamik yapısı nedeniyle kriyo-EM görselleştirme için idealdi.
Üniformalı Hizmetler Sağlık Bilimleri Üniversitesi’nden arkeal CODH ve ACS konusunda otorite olan Dr. David Grahame ve Drennan Laboratuvarı ben gelmeden önce birlikte çalışmaya başlamıştı.
Grahame emekli olmadan hemen önce yaklaşık bir gram enzim kompleksi çıkardı ve yüzlerce litre arke yetiştirdi; daha sonra yapısal olarak karakterize edilmesi için Drennan Laboratuarına gönderdi. Her bir kriyo-elektron mikroskobu incelemesi için bir mikrogram protein yeterlidir. Bir yapısal biyoloğun hayali, teoride bir milyon test için yeterli olan sadece bir gram proteine erişebildiğinde gerçekleşir.
Bloboloji alanı
Çalışmalarıma fazla miktarda protein ve potansiyel bir hedefe yönelik bu yeni yaklaşımla başladım. MIT’deki son teknoloji kriyo-EM laboratuvarında kriyo-EM örneğimi işledim ve veri topladım. Veri toplarken fotoğraflarda ilgilendiğim kompleks gibi görünen büyük protein kompleksleri görülebiliyordu. Saflaştırılmış CODH profiline uyan bazı küçük proteinler de gözüme çarpıyordu. İzole edilmiş CODH’un yapısı sayesinde, odağımı daha büyük protein komplekslerini içeren verileri işlemeye kaydırabildim.
İlk veri kümemin işlenmesini biraz hayal kırıklığı ile tamamladım. Çözünürlüğüm çok düşük olduğu için hangi blobun hangi proteine karşılık geldiğini veya nasıl bir araya gelmeleri gerektiğini söyleyemiyordum; atomlar yerine amorf bloblar görüyordum. Geçmiş yılların “blobolojisi”, bir devrimden sonra gerçekleştirilen kriyo-EM’den daha uygun görünüyordu.
Bir doktora programında başarısız deneyler kaçınılmazdır, ancak proje henüz ilk aşamalarındaydı.
Hiçbir gelişme olmadı. Ne yaparsam yapayım bloboloji alanında sıkışıp kalmıştım. Bu fikrin başarısızlığa mahkum olduğunu anladıktan sonra geri çekildim. Başka görevlere odaklanırken aklım arkeal CODH ve ACS’den uzaklaştı.
Birkaç ay sonra kriyo-EM tesisi tarafından bukalemun adı verilen yeni bir numune hazırlama aparatı kullanıcılara sunuldu. Chameleon, numune hazırlama sürecini otomatikleştirmek ve numunelerin kalitesini artırmak için tasarlanmıştır. Cihazı denemeyi teklif ettim çünkü elimde hâlâ çok fazla malzeme vardı.
Tesis ayrıca ben veri toplamaya başlamadan hemen önce yeni bir yazılım güncelleyerek toplanan verilerin gerçek zamanlı olarak işlenmesini sağladı. Önceden, verilerimi gözden geçirmem ve ilgilendiğim kompleksle uyumlu büyük protein komplekslerini manuel olarak seçmem gerekiyordu; şimdi, yazılım bunu sizin için yapmak için otomatik prosedürler kullanıyor.
Yeni programdan daha fazla ayrımcılık beklememe rağmen, canlı işleme sonuçları beni hoş bir şekilde şaşırttı. İşlem sırasında örneğimde bir CODH ve ACS kompleksi gördüğümde şaşırdım.
Hem CODH hem de ACS’nin birkaç kopyasına sahip olan tam kompleksin aksine, bu tek kopyalı kompleks her birinden yalnızca bir tanesine sahipti. Bu, fikre olan hevesimi yeniden canlandırdı.
Bu yeni hedef sonunda çözünürlük devrimine katılmamı ve blobolojiyi terk etmemi sağlayabilir miydi?
Ek testler, veri toplama ve işlem süresinden sonra örnekte üç farklı CODH durumu tespit edildi. Bu durumlar izole haldeki CODH, ACS’nin bir kopyasını içeren CODH ve ACS’nin iki kopyasını içeren CODH idi. MIT’deki Davis Laboratuvarı tarafından oluşturulan MAVEn aracını kullanarak bu üç durumu birbirinden ayırt edebildim. Verileri analiz etmeyi bitirdiğimde, her üç durumu da atomik seviyeye kadar indirgemiştim.
Bu çalışma bize ilk kez arkeal ACS’nin net bir resmini veriyor. Arkeal ACS aktif bölgesinin yapısının neye benzediği belirsizdir çünkü enzim bakteriyel olandan büyük ölçüde farklıdır ve enzimin büyük bir kısmı arkeada yoktur.
CODH ile kompleks yapımızda arkeal ACS’nin aktif bölgesini bakteriyel ACS’ninki ile karşılaştırdığımızda bu bizim için bir sürpriz oldu. Arkeal CODH, eksik ACS bileşenini telafi ederek bu benzerliği sağlar.
ACS aktif bölge ortamının bakteri ve arkelerde ne kadar benzer olduğu düşünüldüğünde, milyarlarca yıllık evrim boyunca korunmuş bir aktif bölge gözlemliyor olmamız oldukça muhtemeldir.
Deney, muazzam, dinamik protein kompleksinin yapısını çözme hedefine ulaşamadı, ancak bana büyüleyici bilgiler sağladı. Çözünürlük devriminin henüz sona ermediği aşikâr ve yapısal biyolojinin ilerleyişine tanık olmak heyecan verici. 2015’te mevcut olan araçlar bu keşiflere ulaşmamı sağlayamazdı. Çığır açan yeni teknolojilerin sürekli gelişimi sayesinde kriyo-EM evrim geçirdi ve daha da geçirecek.
Kaynak: chemistry.mit.edu/chemistry-news
