Araştırmacılar, gen düzenleme aracı CRISPR’ı kullanarak bakteri mühendisliği için geliştirilen virüsleri modifiye ediyor.
Bakterileri enfekte eden virüslerin genomlarını değiştirebilme özelliğiyle çığır açan gen düzenleme aracı CRISPR, bilim dünyasında bir kez daha tartışmalara yol açıyor.
CRISPR öncüleri Jennifer Doudna ve Jill Banfield liderliğindeki bir ekip, ilaçlara dirençli hastalıkların tedavisine yardımcı olabilecek ve bilim insanlarının antibiyotik kullanmadan mikrobiyomları yönetmelerini sağlayabilecek bir buluş olan CRISPR’ın nadir bir versiyonunu kullanarak özel bakteriyofajlar geliştirdi. Nature Microbiology dergisinde yayınlanan çalışma, bilim dünyasının uzun süredir bakteriyofaj mühendisliği sorunuyla mücadele etmesi nedeniyle kayda değer bir başarıdır.
Dünya üzerindeki en yaygın ve çeşitli biyolojik gruplardan biri bakteriyofajdır. Doudna’nın grubunda doktora sonrası araştırmacı olan ilk yazar Benjamin Adler’e göre bu düzenleme prosedürü, daha önceki yöntemlerin aksine bakteriyofajların muazzam genetik çeşitliliğini ortadan kaldırıyor. “Keşif parmaklarımızın ucunda; o kadar çok ilginç yön var ki!”
Genellikle faj olarak bilinen bakteriyofajlar, genetik bilgilerini bakteri hücrelerine enjekte etmek için şırınga benzeri bir cihaz kullanır. Daha sonra çoğalmak için konakçılarının protein üretme sistemlerini devralıyor ve bu süreçte sıklıkla bakterileri öldürüyorlar.
Birçok bakteri ve arke, fajlarla savaşmak için CRISPR-Cas immünolojik savunma mekanizmasını kullanır. CRISPR-Cas sistemi, faj genlerindeki dizilere tamamlayıcı olan kısa RNA parçacıkları tarafından yerine yönlendirildikten sonra faj genlerini zararsız parçalara keserek etkisiz hale getiren makas benzeri enzimlerden oluşur. Bu, mikrobun istilacı genetik materyalin ne zaman yerleştirildiğini tespit etmesini sağlar.
Fajlar, bakteriyel savunma ve faj saldırısı arasında süregelen evrimsel çatışma nedeniyle binlerce yıl boyunca uzmanlaşmak zorunda kalmıştır. Çok sayıda mikroorganizma olduğu için, her biri farklı adaptasyonlara sahip çok sayıda faj da vardır. Faj düzenleme, bu organizmaların inanılmaz çeşitliliği nedeniyle zordur ve bu da onları birçok CRISPR tekniğine karşı dirençli hale getirir.
Adler’e göre, “Fajlar savunmadan kaçınmak için anti-CRISPR’lardan kendi DNA’larını düzeltmede iyi olmaya kadar çeşitli tekniklere sahiptir.” Bu nedenle, faj genomlarının doğasında bulunan ve onları mikroorganizmaları kontrol etmede bu kadar becerikli kılan özelliklerin, genomlarını değiştirmek için evrensel bir araç yaratmanın bu kadar zor olmasının da nedeni olduğu söylenebilir.
Projenin kurucuları Doudna ve Banfield, 2008 yılında bir CRISPR araştırması üzerinde yaptıkları ilk ortak çalışmadan bu yana çeşitli CRISPR tabanlı teknolojiler yarattılar. Doudna ve diğer işbirlikçisi Emmanuelle Charpentier 2020 yılında Nobel Ödülü’ne layık görüldüğünde, komite bu çalışmaya atıfta bulundu.
Berkeley Lab ve UC Berkeley’den Doudna ve Banfield liderliğindeki araştırmacılar, CRISPR-Cas13 savunma sisteminin özelliklerini incelerken, bu sistemin çok çeşitli fajlara karşı etkili olduğunu öğrendiler.
Adler’e göre, çok az organizmanın kullandığı göz önüne alındığında, CRISPR-Cas13’ün fajlarla mücadele edebilmesi sürpriz oldu. CRISPR-Cas13 sistemi öncelikle tek sarmallı viral RNA’yı hedef alır ve keser, bu nedenle bilim adamları testlerde yok ettiği fajların hepsinin çift sarmallı DNA kullanarak enfekte olması gerçeğiyle iki kat şok oldular. Diğer virüsler gibi bazı fajların genomları DNA’dan oluşurken, diğerleri RNA’dan oluşuyor. Ancak RNA, tanınan tüm virüsler tarafından genlerini ifade etmek için kullanılır.
Hepsi E. coli suşlarını enfekte eden ancak çok farklı genomlara sahip dokuz farklı DNA fajı, CRISPR-Cas13 sistemi tarafından başarıyla öldürüldü.
Berkeley Lab’ın Biyobilimler Alanında çalışan bir bilim insanı olan faj uzmanı Vivek Mutalik’e göre bu sonuçlar, CRISPR sisteminin, protein çevirisinden önce bakterinin kendi enzimleri tarafından DNA’dan dönüştürüldükten sonra RNA’larını hedef alarak çeşitli DNA tabanlı fajlara karşı savunma yapabileceğini gösteriyor.
Bilim insanları daha sonra bu yöntemin faj genomlarını sadece savunmaya yönelik olarak parçalamak yerine, onları değiştirmek için de kullanılabileceğini gösterdi.
Daha sonra, doğal faj dizileri ile çevrelenmiş istenen faj dizisine sahip DNA segmentleri oluşturdular ve bunları fajın hedef bakterilerine yerleştirdiler. Fajlar onları enfekte ettiğinde DNA içeren mikroorganizmaların içinde çoğalan fajların küçük bir kısmı değişen DNA’yı aldı ve genomlarındaki orijinal dizinin yerine koydu. Homolog rekombinasyon bu aşamada kullanılan iyi bilinen bir DNA düzenleme işlemidir. Faj araştırmalarında uzun süredir devam eden sorun, bu aşama olan faj genomu düzenlemesinin çok iyi çalışmasına rağmen, değiştirilmemiş fajların daha büyük havuzundan değiştirilmiş fajları izole etmenin ve yeniden üretmenin çok zor olmasıdır.
CRISPR-Cas13 bu noktada devreye giriyor. İkinci adımda araştırmacılar, tipik faj genom dizisini tespit edebilen ve buna karşı koyabilen bir CRISPR-Cas13 sistemine sahip farklı bir konak mikrop türü yarattı. CRISPR savunma mekanizması, ikinci tur konakçılara maruz kaldıklarında orijinal dizilime sahip fajları ortadan kaldırdı, ancak değiştirilmiş birkaç faj bunu başarabildi. Kalıcı oldular ve çoğalmaya devam ettiler.
İki aşamalı süreçlerde oluşturulan fajların %99’undan fazlası, büyük çoklu gen silmelerinden tek bir amino asidin tam olarak değiştirilmesine kadar değişen modifikasyonlara sahipti. Bu başarı oranı, üç bağımsız E. coli fajı ile yapılan deneylerde gösterildi.
Mutalik’e göre faj mühendisliği üzerine yapılan bu çalışma, faj biyolojisindeki en önemli dönüm noktalarından birini temsil ediyor. “Bakterilerin ve fajlarının kusursuz mühendisliği, temel bilim için önemli etkilere sahip olmakla birlikte, fajların mikrobiyal ekoloji, evrim, popülasyon dinamikleri ve virülans üzerindeki etkisi nedeniyle biyoekonominin tüm yönlerinde gerçek bir fark yaratma potansiyeline de sahiptir. Bu faj mühendisliği becerisi sadece insan sağlığı üzerinde değil, aynı zamanda biyo-üretim, tarım ve gıda üretimi üzerinde de etkili olacaktır.
İlk bulgularından cesaret alan araştırmacılar, şimdi mikrobiyal toprak popülasyonları üzerinde etkisi olan fajlarla başlayarak CRISPR sisteminin uygulama alanını genişletmeye çalışıyorlar. Ayrıca faj genomlarında bulunan genetik bulmacaları araştırmak için de kullanıyorlar.
Kaynak: Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing” by Benjamin A. Adler, Tomas Hessler, Brady F. Cress, Arushi Lahiri, Vivek K. Mutalik, Rodolphe Barrangou, Jillian Banfield and Jennifer A. Doudna, 31 October 2022, Nature Microbiology.
