- Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley araştırmacıları, lazer tabanlı faz plakası ile kriyo-EM’de küçük protein görüntüleme çözünürlüğünü iyileştirdi.
- Yöntem, hemoglobin proteininde çözünürlüğü 4,46 angstromdan 3,09 angstroma yükselterek mevcut tekniklerin erişemediği protein yapılarının incelenmesinin önünü açtı.
- Araştırmacılar, odak dışı görüntüleme stratejisini gereksiz kılan bu tekniğin, gelecekte çözünürlükte ek kazanımlar sağlayabileceğini öngörüyor.
Kriyojenik elektron mikroskobu (cryo-EM), karmaşık biyomoleküllerin yapılarını aydınlatmak için hayati bir araç haline geldi. Ancak en iyi cihazlar bile, insan vücudunda bulunan proteinlerin yaklaşık %90’ını oluşturan küçük proteinlerin net görüntülerini üretmekte zorlanıyor.
Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley Araştırmacısı Müller ve ekibi, bir elektron demetinin fazını kontrol etmek için lazer tabanlı bir yöntem geliştirerek kriyo-EM görüntülerinde daha yüksek kontrast elde etti. Gösterimlerde, bu yöntem küçük protein görüntülerinin çözünürlüğünü artırarak biyologların mevcut tekniklerin erişemeyeceği yeni bir protein yapıları alanını keşfetmesinin yolunu açtı.
Kriyo-EM ve Faz Plakası İhtiyacı
Kriyo-EM, binlerce hatta milyonlarca özdeş molekül içeren donmuş numunelerden üç boyutlu görüntüleri yeniden oluşturuyor. Numunelerin dondurulması, onları doğal duruma yakın bir şekilde korurken aynı zamanda elektron demetinin zararlı etkilerini de azaltıyor. Ancak elektronlar biyolojik örneklerle yalnızca zayıf bir şekilde etkileşime giriyor ve bu durum görüntü kontrastını sınırlıyor. Yüksek gürültü seviyeleriyle birleşen zayıf görüntü kontrastı, incelenebilecek moleküllerin boyutu üzerinde bir alt sınır oluşturuyor.
Kontrastı iyileştirmenin bariz bir yolu, bir dalganın fazını belirli bir miktar (genellikle bir açıyla gösterilir) değiştiren bir bileşen olan faz plakası eklemektir. Fazı 90° değiştiren faz plakalarına çeyrek dalga plakaları da denir ve optik mikroskopide neredeyse saydam olan örnekleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılır. Numuneden geçen ışık zayıflamaz, ancak ışığın bir kısmı numune tarafından kırıldığında küçük faz değişiklikleri kazanır. Faz plakası, kırılmamış referans sinyalinin fazını kaydırmak için kullanılır. Bu ek faz kaymasıyla, kırılan ve kırılmayan ışınlar arasındaki girişim, iki ışın kameraya çarptığında kontrast üretir.
Lazer Tabanlı Faz Plakasının Geliştirilmesi
Önceki çalışmalar bu şemayı bir kriyo-EM’de uygulamaya çalışmıştı, ancak fiziksel bir faz plakası eklenmesinin sinyal kaybına neden olduğu ve hatta görüntülerin çözünürlüğünü tehlikeye attığı gösterilmişti. Araştırmacılar bu sorunu çözmek için, grubun ilk olarak 2010 yılında önerdiği lazer tabanlı bir faz plakası geliştiriyor. Fikir, uyarılmış Compton saçılması yoluyla elektron demetiyle etkileşime giren yoğun bir lazer kullanmak. Bu saçılma, demeti oluşturan elektron dalgalarının fazını değiştiriyor.
Bununla birlikte, 90°’lik bir faz kayması elde etmek, yaklaşık 400 GW/cm2’lik sürekli bir lazer yoğunluğu gerektiriyor ve bu yoğunluk daha önce yalnızca darbeli lazerler tarafından üretilebiliyordu. 2021’de ekip, içbükey aynalı yüzeylere sahip bir optik boşluğun içinde bir lazer ışınını hapsederek bu rekor performansı ilk kez elde etti. Boşluk içindeki rezonans etkileri, lazer ışınının gücünü 80 kW’a yükseltirken aynı zamanda onu 6,7 µm’lik bir nokta boyutuna odaklıyor. Bu kadar yüksek yoğunluklarda, boşluk içindeki rezonans koşullarını sürdürmek önemli bir zorluk haline geliyor. Araştırmacı Müller, “Radyasyon basıncı aynaları birbirinden uzaklaştırıyor, bu nedenle uzunluk değişikliklerine karşı koymak ve boşluğu hassas bir şekilde rezonansta tutmak için birden fazla geri besleme döngüsünü optimize etmemiz gerekiyor” diyor.
Deney Sonuçları ve Performans Karşılaştırması
Eski bir elektron mikroskobu ile yapılan ilk deneyler, lazer faz plakasının konseptini kanıtladı, ancak elde edilen görüntüler iyileştirilmiş bir çözünürlük göstermedi. Bu yeni çalışmada araştırmacılar, lazer faz plakasını en yeni teknoloji bir kriyo-EM’e entegre etti ve performansını iki numune kullanarak test etti. Bunlardan biri, kaslarda bulunan ve geleneksel bir kriyo-EM ile görüntülenebilecek kadar büyük olan bir protein olan aldolazdı. Diğeri ise, mevcut makinelerin alt sınırını test edecek kadar küçük olan kan bazlı bir protein olan hemoglobindi.
Lazer faz plakasının her iki protein için de görüntü çözünürlüğünü iyileştirdiği gösterildi, ancak fayda daha küçük olan hemoglobin molekülü için daha belirgindi. Bir deneyde, lazer açıldığında hemoglobin yapısının çözünürlüğü nispeten zayıf olan 4,46 angstromdan 3,09 angstroma yükseldi.
| Protein | Lazer Kapalı Çözünürlük (Å) | Lazer Açık Çözünürlük (Å) |
|---|---|---|
| Hemoglobin | 4,46 | 3,09 |
Her iki numune için de lazer faz plakası, kriyo-elektron tomografisi adı verilen daha yeni bir teknik için özellikle önemli olabilecek görüntüleme performansında başka iyileştirmeler sağladı. Bu “kriyo-ET”, hücrelerin veya diğer karmaşık numunelerin içindeki bireysel nesnelerin üç boyutlu görüntülerini oluşturmak için kullanılabiliyor.
Gelecek Perspektifleri ve Bilimsel Önem
Müller, lazer faz plakasının kullanımının dolaylı olarak çözünürlükte daha fazla kazanıma yol açabileceğine inanıyor. Geleneksel kriyo-EM’de, kısmi faz kontrastı sağlamak için elektron demeti kasıtlı olarak odak dışı bırakılıyor, ancak lazer faz plakası bu stratejiyi gereksiz kılıyor. Müller, “Odak içi görüntülemeye geçiş, mevcut çalışmada gösterdiğimiz kadar olmasa da çözünürlüğü en azından aynı oranda artıracaktır” diyor.
Kriyo-EM üzerine yaptığı çalışmalarla 2017 Nobel Kimya Ödülü’nü paylaşan Richard Henderson, bu gelişmenin kriyo-EM’in erişimini daha küçük proteinlere genişletebileceği için heyecan verici olduğunu belirtiyor. Henderson, “Kriyo-EM’in iyi bir çeyrek dalga plakasına şiddetle ihtiyacı var ve Berkeley’de geliştirilen lazer faz plakası bu ihtiyacı karşılama konusunda büyük umut vaat ediyor” diye ekliyor.
Ayrıca bakınız: Elektron Mikroskobisi ile Tek Molekül Görüntülemede Yeni Rekor
İlgili Diğer Haberler
- Kriyo-EM Tekniği ile Kanser Proteinlerinin Yapısı Çözüldü
- Lazer Teknolojisinin Mikroskopideki Yeni Uygulamaları
Odak Anahtar Kelime: Lazer faz plakası
Yayın Tarihi: 25 Haziran 2026
Yazar: Fizikhaber Editör Ekibi
Kaynak: Physics.org – Laser Beam Brings Contrast to Electron Microscopy
